hTERT成纤维细胞培养方案 [复制链接]

hTERT成纤维细胞为永生化子宫内膜成纤维细胞(THESC)具有延长的寿命，并且在核型、形态和表型方面与原代亲代细胞相似。在功能上，THESCs显示激素治疗后蜕膜化的生化终点。

THESCs来源于从患有肌瘤的成年女性身上获得的基质细胞。原代基质子宫内膜细胞通过用来自包装细胞系pA-hTERT的上清液感染而永生化，该细胞系表达hTERT和嘌呤霉素抗性基因。

hTERT成纤维细胞培养方案如下：

一、所需材料

Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12

碳酸氢钠

ITS+UniversalCultureSupplementPremix

嘌呤霉素

木炭/葡聚糖处理的胎牛血清

胰蛋白酶-EDTA溶液（HBSS中的0.25%胰蛋白酶/0.53mMEDTA）

细胞培养测试的DMSO

实验耗材：T75细胞培养瓶、T25细胞培养瓶、nest锥形瓶、移液枪吸头等

实验室仪器：-80冰箱、二氧化碳振荡摇床、恒温水浴锅、移液器、液氮罐、倒置显微镜等。

二、完全培养基的制备

这些细胞系的基础培养基是DMEM/F12，辅以：

1.5克/升碳酸氢钠

1%ITS+UniversalCultureSupplementPremix

纳克/毫升嘌呤霉素

10%木炭/葡聚糖处理的胎牛血清

三、冷冻细胞的处理程序和培养的启动

为确保高活力，解冻小瓶并在收到后尽快开始培养。如果到达后需要储存冷冻培养物，请将小瓶储存在液氮蒸气中，而不是-70°C。在-70°C下储存会导致活性丧失。

有关从每批ATCC子宫内膜成纤维细胞中回收的活细胞总数，请参阅产品信息表最后一页上提供的批次特定信息。

准备一个含有推荐的完全培养基的25cm2或75cm2培养瓶。在添加小瓶内容物之前，应将含有生长培养基的容器置于培养箱中至少15分钟，以使培养基达到其正常pH值（7.0至7.6），并避免在恢复过程中培养基碱度过高的细胞。

在37°C水浴中轻轻搅拌解冻小瓶。为减少污染的可能性，请将O形圈和盖子远离水。解冻应该很快（大约2分钟）。

1.细胞解冻后，请尽快从水浴锅中取出，并使用70%乙醇溶液来进行净化。操作过程需要在无菌环境中进行，避免污染。

2.将小瓶内容物转移到含有6.0至8.0mL完全培养基的离心管中，并以大约xg的速度将细胞悬浮液离心5至7分钟。

3.丢弃上清液并将细胞重新悬浮在新鲜的生长培养基中（有关推荐的稀释比，请参阅特定于批次的信息）。将此悬浮液添加到准备好的培养容器中。

4.在37°C、5%CO2加湿培养箱中孵育培养物。

四、继代培养程序

使用T75锥形瓶进行培养。

1.有关细胞传代培养的浓度，请参阅产品信息表。当确定细胞已准备好进行传代培养时，继续下一步。

2.取出并丢弃介质。

3.向烧瓶中加入2.0至3.0mLTrypsin-EDTA溶液，在倒置显微镜下观察细胞，直至细胞层分散（通常在5至15分钟内）。

4.添加6.0至8.0mL的完全生长培养基，并通过轻轻移液吸出细胞。

5.将细胞悬浮液转移到15mL离心管中，并以大约xg的速度旋转5至10分钟。

6.丢弃上清液并在新鲜生长培养基中重悬细胞。将适当的细胞悬浮液等分试样添加到新的细胞摇瓶中。

五、细胞冻存

在以下培养基中冷冻细胞：95%完全生长培养基，5%DMSO。将小瓶储存在液氮蒸气中。避免将小瓶浸入液氮中。